鼠肺血管內皮細胞的分離與培養方法

　　小鼠肺血管內皮細胞（PECs）是肺部血管的關鍵組成部分，對肺循環的穩定和氣體交換功能具有重要作用。研究肺血管內皮細胞有助于了解肺部疾病的機制，如肺動脈高壓、肺水腫及其它血管相關疾病。本文簡要介紹了小鼠肺血管內皮細胞的分離與培養方法。

　　一、材料與設備

　　1.動物模型：健康C57BL/6小鼠（8-12周齡，雄性或雌性均可）

　　2.細胞培養基：EndothelialCellMedium（ECM），或含有10%胎牛血清（FBS）、1%抗生素（青霉素/鏈霉素）的DMEM/F-12混合培養基

　　3.試劑與工：胰蛋白酶、磷酸鹽緩沖液（PBS）、含膠原酶和DNA酶的消化液、離心管、培養皿、無菌操作臺

　　二、小鼠肺血管內皮細胞的分離步驟

　　1.動物麻醉與處死：使用異氟烷麻醉小鼠，通過頸部脫臼處死。之后迅速將小鼠胸腔暴露，并剪開胸腔，暴露出雙側肺臟。

　　2.肺臟灌注：在肺動脈處插入針頭，通過心臟將1×PBS緩沖液注入肺臟，進行灌注清洗，去除肺臟表面的血液。此步驟有助于減少血液中的紅細胞對細胞分離的干擾。

　　3.肺組織消化：將灌注清洗后的肺組織剪碎，放入含有膠原酶（1mg/mL）和DNA酶（20U/mL）的消化液中，37℃下消化30-45分鐘。消化過程中輕輕吹打以促進組織分解。

　　4.細胞過濾與收集：消化后，將細胞懸液通過70μm細胞過濾網過濾，去除未完全消化的組織塊。收集濾液，加入PBS進行多次離心洗滌（500×g，5分鐘），去除消化液和雜質。

　　5.細胞培養：將分離得到的細胞重新懸浮在培養基中，并接種于培養皿（T25或更大培養瓶）。使用含10%FBS的ECM培養基，置于37℃、5%CO?的培養箱中培養。

　　三、小鼠肺血管內皮細胞的鑒定

　　1.形態觀察：在培養初期，血管內皮細胞呈典型的多角形或長梭形，生長為單層鋪展的細胞。

　　2.免疫熒光染色：使用血管內皮細胞特異性標志物進行鑒定，如抗-CD31、抗-VE-cadherin、抗-vWF抗體。通過免疫熒光染色和顯微鏡觀察，驗證細胞為內皮細胞。

　　3.功能鑒定：細胞形成的血管樣結構、白細胞黏附、流動性測試等也可作為功能鑒定方法。

　　四、培養注意事項

　　1.培養環境：維持細胞在37℃、5%CO?環境下生長。定期更換培養基，通常每2-3天一次，確保細胞的營養供給。

　　2.細胞傳代：當細胞密度達到80%-90%時，可用0.25%胰蛋白酶處理進行傳代。傳代時應盡量避免過度操作，保持細胞的良好狀態。

　　3.污染控制：在整個操作過程中，嚴格遵守無菌操作，防止細菌、真菌等污染，影響細胞的生長與實驗結果。

　　小鼠肺血管內皮細胞的分離與培養技術是研究肺血管生理及病理的基礎方法。通過適當的灌注、消化和細胞分離手段，可以獲得純度較高的肺血管內皮細胞，為相關疾病模型的建立及藥物篩選提供了重要的實驗平臺。在實際應用中，細胞培養環境和操作細節對實驗結果至關重要，需謹慎操作與優化。